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Actividad inmunogénica del anticuerpo scFv antiDEC-205 fusionado a proteínas virales de dengue ...
Start Date/Time: Monday, December 13, 2010 2:30 PM
End Date/Time: Monday, December 13, 2010 4:30 PM
Recurring Event: EVENTO POR UNICA VEZ
Importance: Normal Priority
Category:
Exámenes
Location: Auditorio de la Unidad
Description:

Examen de Grado

“Actividad inmunogénica del anticuerpo scFv antiDEC-205 fusionado a proteínas virales de dengue obtenido mediante expresión transitoria en plantas”.

Biól. Lucía Nancy Coconi Linares

Comité tutorial:
Asesor: Dr. Miguel A. Gómez Lim
Dr. Edmundo Lozoya Gloria
Dra. Leticia Cedillo Barrón (externo)

Lunes 13 de Diciembre de 2010, 14:30 hrs.
Auditorio de la Unidad.

Programa: Maestría



RESUMEN
El interés creciente por mejorar y desarrollar vacunas contra diferentes enfermedades infecciosas se ve enfrentado a numerosos cuellos de botella que limitan sus alcances. Entre los principales obstáculos se encuentran la especificidad y el estímulo adecuado de la respuesta inmune, las dosis de administración y los altos costos de producción. En este sentido las plantas han sido modelos de estudio muy eficientes por su bajo costo de producción y por la expresión adecuada de proteínas recombinantes. Para muchas enfermedades infecciosas como es el caso del dengue, se requiere inducir una respuesta tanto humoral como celular para combatir al virus y las vacunas convencionales aún no han alcanzado este objetivo. Una alternativa prometedora es el uso de anticuerpos contra receptores específicos acoplados a los antígenos de interés, lo cual permite dirigir a los antígenos hacia las células dendríticas. Considerando este enfoque, en este trabajo se diseñó una estrategia basada en la fusión de un anticuerpo del fragmento variable de cadena sencilla (scFv) contra el receptor DEC-205 expresado en plantas de Nicotiana benthamiana y Lactuca sativa con las proteínas del virus dengue  de envoltura (E), el dominio III (EIII) y NS1. La expresión de las proteínas scFv DEC-205/E,  scFv DEC-205/NS1 y scFv DEC-205/E-NS1 se obtuvieron incompletas, lo cual no sucedió con la proteína scFv DEC-205/EIII  (48 KDa). Por las dificultades de expresión de las fusiones con E y NS1 solo se purificaron por geles preparativos las proteínas scFv DEC-205/EIII,  así como scFv DEC-205/ollas y GFP (como controles) para los ensayos de inmunización. Los rendimientos de las proteínas puras fueron de 0.1 mg/g de tejido vegetal. Los sueros de los ratones inmunizados con scFv DEC-205/EIII fueron capaces de reconocer al virus dengue en su forma nativa, así como a la proteína E completa. Asimismo, la proteína recombinante también fue capaz de reconocer sueros de pacientes infectados con el virus dengue. En ensayos de neutralización del virus dengue por reducción de placas, los anticuerpos producidos por los ratones inmunizados con la proteína scFv DEC-205/EIII mostraron una mayor capacidad de neutralización del virus dengue. La aplicación de dosis pequeñas y tan sólo dos inmunizaciones generó una respuesta inmune prolongada y de memoria frente al virus dengue sin requerir la adición de adyuvantes. Esta es la primera vez que se reporta una fusión de un anticuerpo scFv con antígenos del virus dengue en plantas con alta inmunogenicidad y capacidad protectora.


ABSTRACT

The increasing interest to improve and develop vaccines against various infectious diseases has to deal with numerous bottlenecks that limit its scope. Among the main obstacles include the specificity and adequate stimulation of the immune response, the administration dose and high production costs. In this way, the plants are valuable systems because of its low production cost and the appropriate expression of recombinant proteins. To treat many infectious diseases, such as dengue, demand to induce both humoral and cellular response to combat the virus; conventional vaccines have not yet achieved this goal. One promising alternative is the use of antibodies against specific receptors coupled to the antigen of interest, allowing the antigen targeting to dendritic cells to improve immunity. In this study, a strategy based on the fusion of antibody single chain fragment variable (scFv) against the DEC-205 receptor expressed in plants Nicotiana benthamiana and Lactuca sativa with proteins of the dengue virus envelope, E, domain III (EIII), and NS1 was designed. In all cases the proteins expression was confirmed by western blot.  The recombinant proteins scFv DEC-205/E, scFv DEC-205/NS1 and scFv DEC-205/E-NS1 were obtained in a truncated form; nevertheless, in the case of scFv DEC-205/EIII a protein complete (48 kDa) was obtained. Because of the difficulties of expression of E and NS1 proteins, only  the  proteins  scFv DEC-205/EIII, scFv DEC-205/ollas and GFP (as control) were purified  for immunization trials by preparative gels. The yields of the pure proteins were 0.1 mg/g of plant tissue. The sera from mice immunized with scFv DEC-205/EIII were able to recognize the dengue virus in its native form, as well as the complete E protein. Furthermore, the recombinant protein was also capable of recognizing sera from patients infected with dengue virus. In neutralization tests of dengue virus by plaque reduction, the antibodies produced by mice immunized with scFv protein DEC-205/EIII showed a greater capacity for dengue virus neutralizing activity compared with antibodies produced by mice immunized using complete E protein. The application of small doses and only two immunizations produced a prolonged immune response and memory cells against dengue virus without requiring the addition of adjuvants. This is the first report for the use of fusion scFv antibody to dengue virus antigens in plants with high immunogenicity and protective capacity.

Created by SuperUser Account On Tuesday, November 30, 2010 12:00 AM

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