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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN


Es claro que la concepción teórica del microscopio electrónico de transmisión es muy parecida a la del microscopio de luz de campo claro. Sin embargo, la innovación tecnológica de este tipo de microscopía fue sustituir la iluminación a través de fotones por la iluminación de los especímenes a través de un haz fino de electrones acelerados a una gran velocidad, por lo que este cambio en la fuente de iluminación, además del uso de lentes electromagnéticas confiere al microscopio electrónico una alta resolución, lo que le convierte en una herramienta indispensable en muchos campos de la biología y la medicina. La función más habitual en el Microscopio Electrónico de Transmisión es de dar imágenes de objetos inmóviles, sin vida, irradiándolos y formar imágenes con la radiación emergente.
 

¿CÓMO SE FORMA LA IMAGEN?


Por lo general las muestras biológicas que se observan en el MET son cortes muy delgados (60 -90 nm de espesor); ocasionalmente se estudian pequeñas estructuras depositadas directamente sobre las rejillas. Sin embargo, la regla general es que el espesor del material no debe ser mayor de 150 nm, esto asegura que el haz de electrones pueda atravesar la muestra. Para asegurar estas condiciones se debe preparar la muestra para ser cortada. Esta es uno de los servicios que se proporcionan en el Laboratorio de Microscopía del CINVESTAV-Irapuato.


PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN


Todas las restricciones fisicoquímicas que impone el microscopio electrónico de trasmisión debe resolverse durante la preparación del material biológico. Por lo que debe cumplirse un protocolo básico que incluye la fijación de tejidos, deshidratación, inclusión, corte, montaje en rejillas y contraste (incluyendo inmunocitoquímica). Posteriormente se pueden observar en el microscopio electrónico de transmisión, adquirir la imagen y procesarla para su análisis. Este servicio incluye un concepto de capacitación del alumno o personal que así lo indique la institución contratante.


EQUIPOS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN


Ultramicrotomo marca LKB BROMMA modelo NOVA
Maquina hacedora de cuchillas de vidrio de la marca LKB BROMMA modelo 7800.
Microscopio Electrónico de Transmisión FEI/PHILIPS modelo Morgagni M-268, el cual puede trabajar en un rango de 40-100 Kv con resolución de 0.2 nm. Para la adquisición de imágenes cuenta con cámara digital MegaView III acoplado al software ANALYSIS.
 


MICROSCOPÍA MULTIFOTÓN Y SISTEMA CONFOCAL AUXILIAR


La microscopía de fluorescencia fue revolucionada con el invento y desarrollo de la Microscopia Confocal de Barrido Láser (MCBL). Este equipo es el único equipo capaz de realizar un análisis y representación tridimensional de las estructuras biológicas. Son embargo, existen nuevas mejoras con el desarrollo de la tecnología multifotón, por ejemplo, aumenta el número de dimensiones con las que se puede analizar un fenómeno biológico. Se ha añadido la cuarta dimensión, esta se logra midiendo repetidamente datos tridimensionales en tiempo (microscopia 4D, xyzt). La 5D se logra a través de la introducción del análisis espectral de la luz emitida (xyzt?), es decir la identificación de la huella digital de los compuestos químicos que se encuentran en la muestra. Mayor complejidad se introduce en el sistema multifotón mediante la combinación de estas técnicas, en particular con la formación de imágenes de tiempo de vida de la fluorescencia (FLIM, en inglés) que conduce a obtener datos en seis y más dimensiones.


EQUIPO PARA MICROSCOPÍA MULTIFOTON


Microscopio Zeiss Axio Imager Z2. LSM 880 acoplado a láser pulsado sintonizable Chameleon Vision II para microscopía multifotónica. Cuenta con cabezal de escaneo QUASAR con 3 canales de detección con tecnología Multialcali y GaAsP para realizar obeservaciones de forma eficiente en el espectro visible e invisible. De forma Auxiliar cuenta la unidad confocal con 5 líneas láser de 458, 488, 514, 561 y 633 nm.  El objetivo de este equipo es poder implementar técnicas sofisticadas de imagenología confocal multifotónica en organismo vivos y permitir la visualización de eventos celulares altamente dinámicos. Cuenta con dos módulos NDD (non-descanned detector) para la generación de armónicos secundarios.


Sistema donde se realizan capturas de imágenes en el plano Z para obtener reconstrucciones tridimensionales, proyección de las secciones recopiladas, medición en tres dimensiones, capturas en el área de interés (ROI’s) y multifluorescencia en canales adjuntos, lo que permite visualizar dos o hasta 8 canales simultáneamente con el módulo META.


MICROSCOPÍO DIGITAL DE ALTA RESOLUCIÓN


Microscopio Digital de Alta Resolución VHX-5000 de la marca KEYENCE.


Con lente de mediana resolución (20x a 200x) y alta resolución (500x a 5000x). Este equipo cuenta con un elemento receptor de imagen CMOS de 1/1.8 pulgadas lo cual produce 1600 (H) x 1200 (V) de píxeles virtuales. Método de barrido progresivo y una velocidad de captura de 50 cuadros por segundo (fps) .     Cuenta con 4 modalidades de captura:

  • Normal con 1600 (H) x 1200 (V) Aprox. 1000 líneas de TV
  • 3CMOS con 1600 (H) x 1200 (V) Aprox. 1200 líneas de TV (2 millones de píxeles x Modo 3CMOS, excelente reproducibilidad del color)
  • Alta resolución con 3200 (H) x 2400 (V) Aprox. 1600 líneas de TV
  • Súper alta resolución con 4800 (H) x 3600 (V) Aprox. 2000 líneas de TV o más
  • Súper alta resolución x 3CMOS con 4800 (H) x 3600 (V) Aprox. 2000 líneas de TV o más (18 millones de píxeles x modo 3CMOS, excelente reproducibilidad del color)

El equipo logra obtener hasta     16,770,000 colores millones de colores. Acompañado de iluminación Led atenuable y además de ángulos de inclinación desde 90° hasta 60° permitiendo planos inclinados. Algunos de los usos es la identificación y caracterización de partículas en suspensión o secas, análisis de células y tejidos, análisis de birrefringencia de elementos biológicos y análisis de superficies y contaminantes en metales.


PROCESAMIENTO DE TEJIDOS PARA MICROSCOPÍA FOTÓNICA (HISTOLOGÍA) Y MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (ULTRAESTRUCTURA)


Las muestras se reciben de preferencia frescas (generalmente material vegetal, hongos o cultivos bacterianos), dando comienzo al procedimiento de fijación, para lo cual se puede diseñar un protocolo enfocado en preservar una estructura de interés para el investigador. Posteriormente se diseña un cuadro de limpieza y deshidratación, pasando por un proceso de histoaclarado o pre-inclusión dependiendo el tipo de microscopia que se desea aplicar. En este último punto podemos optar por una inclusión en resinas epóxica, metacrilatos o parafina.  Finalmente, en proceso de corte contamos con los siguientes equipos.

Microtomo de rotación Marca LKB BROMMA, modelo ROTARY-ONE, el cual tiene un rango de corte de 1-30µm con porta cuchillas para perfil bajo y perfil alto desechables o cuchilla afilable.


Ultramicrotomo automático Marca LKB BROMMA, modelo NOVA, el cual tiene un rango de corte de 60-150nm, con porta cuchillas de vidrio y cuchilla de diamante.


Sin embargo, si deseamos realizar técnicas de inmunolocalización o detección de metabolitos que pudieran verse afectado por el procesamiento histológico clásico en el que se usan disolventes como etanol y xilol. Se puede optar por hacer cortes por criostato.


Criostato de la Marca LEICA CM1860 UV Ag Protect. El equipo puede elaborar cortes histológicos con rango de grosor entre 10-90 µm. Presenta un límite de temperatura de congelamiento de -35°C. con platina peltier para procesamiento rápido con 10 posiciones y lámpara UV para desinfección.


EQUIPOS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA


Además, en el laboratorio contamos con microscopio vertical OLYMPUS, modelo BX50 con objetivos U-Plan APO de 4x, 10x, 20x, 40x (multi-inmersión agua desionizada, aceite o glicerol) y 63x (inmersión en aceite), acoplado a cámara de alta resolución para fluorescencia modelo INFINITY3 de la marca LUMENERA sincronizada a través del programa Image Pro Premier 9.1 de la marca MEDIA CYBERNETICS.  Cuenta con 4 filtros de excitación en los rangos de excitación 350, 470 (GFP sin autofluorescencia), 488 y 545 con rangos de emisión de 400, 510 (GFP sin autofluorescencia), 550 y 578.