martes, 22 de julio de 2014
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El trabajo de investigación de nuestro grupo se ha enfocado principalmente en el cultivo in vitro del chile (Capsicum spp.), una especie hortícola de suma importancia a nivel estatal, regional, nacional y mundial. El objetivo general es establecer cultivos in vitro de células, tejidos y órganos para ser utilizados en estudios básicos de fisiología, bioquímica y biología molecular, así como su empleo para la manipulación genética de características de importancia agronómica e industrial. Estos sistemas se han utilizado para la regeneración de plantas, y para la clonación y multiplicación de individuos con ciertas características agronómicas de interés, como es la resistencia a ciertos tipos de virus. Asimismo, el cultivo de anteras de chile se ha aplicado para la generación de líneas puras, homocigotas o isogénicas como alternativa para fijar más rápidamente características de importancia agrícola. La capacidad de los tejidos de chile para regenerar plantas completas in vitro se ha utilizado para el establecimiento de un sistema de transformación genética por medio de la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transferencia de genes foráneos que codifican características de importancia agronómica (resistencia a insectos, hongos, virus) o para la manipulación genética de vías biosintéticas de importancia industrial, como lo es la ruta de los capsaicinoides (compuestos picantes de los frutos de chile). Los cultivos en suspensión y cultivos de tejidos han servido como modelos para el estudio de su capacidad biosintética para la producción de los capsaicinoides, compuestos que normalmente son sintetizados y acumulados en los frutos de chile. La variación generada en los cultivos celulares se ha aprovechado para la selección de clonas o líneas celulares con resistencia a condiciones de déficit de agua (sequía), que, a su vez, nos han permitido llevar a cabo estudios bioquímicos y moleculares relacionados con los mecanismos de resistencia a estrés hídrico a nivel celular.

 

Estudios de expresión diferencial de genes en cultivos celulares de chile resistentes a estrés hídrico y en plantas sometidas a déficit de agua.

 

El chile es un cultivo que se siembra bajo condiciones de riego debido a su sensibilidad al déficit hídrico. Con el fin de tratar de establecer alternativas para el mejoramiento genético de la resistencia al estrés hídrico, se aislaron clonas celulares de chile con diferente tolerancia a déficit hídrico a partir de suspensiones celulares sometidas a presión de selección en presencia de 15% de polietilenglicol (PEG) en el medio de cultivo. Una línea celular sensible (ST) y una clona resistente a 15% de PEG, denominada T7, creciendo tanto en ausencia (P0) como en presencia de 15% de PEG (P15) han sido utilizadas para los estudios de expresión génica por medio de despliegue diferencial. Fragmentos de ADN complementario (ADNc) de expresión diferencial han sido clonados y secuenciados, y su expresión en la clona celular T7 en P0 y P15, así como en la línea ST ha sido confirmada. Asimismo, se ha estudiado la expresión diferencial de aproximadamente 25 fragmentos de ADNc en los cultivos celulares. De éstos, 6 fragmentos demostraron ser de expresión diferencial. El análisis de las secuencias de algunos de los ADNc de expresión diferencial ha permitido encontrar homologías con genes que codifican proteínas tipo ELIP (Early Light Induced Proteins), un factor de transcripción de respuesta a auxinas (Auxin Responsive Factor) y una cetoacil-tiolasa, entre otros (ODE1, ODE2 y ODE14; Fig. 1).

 

 

Figura 1. Hibridaciones northern de 6 diferentes fragmentos de ADNc (ODEs) que mostraron expresión diferencial. ST, línea celular sensible; P0, línea tolerante T7 cultivada en 0% de PEG; P15, línea tolerante T7 mantenida en 15% de PEG.

 

La obtención de las secuencias codificantes completas de los fragmentos de ADNc de expresión diferencial, así como el papel de éstos en los mecanismos de tolerancia al estrés hídrico está actualmente en marcha.

 

Estudios de manipulación genética de la ruta de biosíntesis de los capsaicinoides.

 

Los capsaicinoides son metabolitos secundarios que se producen específicamente en los frutos de los miembros del género Capsicum y les confieren el sabor picante característico. La pungencia está dada por un grupo de análogos que incluyen a la capsaicina, la dihidrocapsaicina, la nordihidrocapsaicina, la homocapsaicina y la homodihidrocapsaicina, de los cuales los 2 primeros constituyen cerca del 90%, siendo mayoritario el contenido de capsaicina. El papel que juegan estos compuestos en la planta no ha sido establecido claramente. Los capsaicinoides, en forma de oleorresinas, se emplean para la fabricación de salsas picantes, parches para eliminar dolores musculares, cremas para abatir el dolor causado por diferentes afecciones como los herpes, artritis y quemaduras, así como para la fabricación de champús, y artefactos de defensa personal contra ladrones, entre otros. Estos compuestos se derivan de la confluencia de 2 rutas biosintéticas: la de los fenilpropanoides y la vía de los ácidos grasos ramificados (Fig. 2). Durante varios años hemos estudiado la capacidad biosintética de cultivos in vitro de chile para la producción de capsaicinoides y hemos demostrado que la producción de estos compuestos es aproximadamente 6 veces menor que la máxima acumulación en los frutos. Esto se debe principalmente a la falta de algunos intermediarios de la ruta de biosíntesis en niveles apropiados, y a la baja actividad de por lo menos 2 de las enzimas de la vía (COMT y CS; Fig. 2). Una de las alternativas para manipular la síntesis de los capsaicinoides es la ingeniería genética de tal manera que se pueda sobreexpresar alguno de los genes de la ruta para incrementar la síntesis y acumulación de estos compuestos o, por el contrario, interferir negativamente en la expresión de genes de la ruta que conduzcan a la disminución o inclusive al bloqueo de su síntesis. Para ello, se han hecho construcciones independientes que contienen al ADNc codificante de una O-metiltransferasa del ácido cafeico (COMT), de una posible aminotransferasa involucrada en la síntesis de vainillilamina a partir de vainillina (AMT), y de una posible 3-ceto-acil-proteína acarreadora sintasa necesaria para la elongación de la cadena de ácidos grasos (KAS), cada una bajo el control del promotor constitutivo 35S del Virus Mosaico de la Coliflor; esto con el fin de sobreexpresar esos genes por medio de transformación genética utilizando a A. tumefaciens como vector. Por otro lado, se están construyendo vectores geminivirales que nos permitan silenciar los genes de esas enzimas, y que conduzcan a la inhibición, de manera no constitutiva, de la síntesis de capsaicinoides en plantas bombardeadas con micropartículas de tungsteno revestidas con las contrucciones geminivirales. A futuro, se espera generar variedades de chile con mayor o menor pungencia, de acuerdo a la demanda del consumidor.

 

 

Figura 2. Ruta biosintética de los capsaicinoides. Las enzimas indicadas en la ruta son: PAL, fenilalanina amonio liasa; Ca4H, cinamato 4-hidroxilasa; Ca3H, cumarato 3-hidroxilasa; COMT, ácido cafeico O-metiltransferasa; CS, capsaicinoide sintasa. Se incluyen también la AMT, una aminotransferasa; y KAS, una 3-ceto-acil-proteina acarreadora sintasa que posiblemente participan en la vía.